鱟試劑測定法，作為藥典如USP<85>章所規定的關鍵方法，廣泛應用于細菌內毒素的檢測。盡管其重要性不言而喻，但該方法的測量結果易受多種分析條件變化的影響，導致LAL（鱟試劑）測定的結果具有較高的可變性。這種可變性主要源自試劑質量、待測產品特性以及檢測方法本身，尤其是在采用光度測定方法（包括顯色法和濁度法）時更為顯著。因此，本文深入探討了LAL測試變異性的原因，并著重闡述了通過實施有效的實驗室質量控制措施來評估和減少這種變化的重要性。

一、鱟試劑測試變異性的來源

（一）鱟試劑

鱟試劑作為一種源自生物的復雜混合物，包含了多種酶和輔助因子，因其非單一純化酶的特性，使得每批裂解物的酶活性難以精確測量。此外，生產過程中引入的緩沖劑和表面活性劑進一步加劇了批次間的差異。為了評估每批鱟試劑的酶活性，制造商通常依賴美國藥典的內毒素參考標準品（RSE），但鑒于RSE的稀缺性和高昂成本，多數實驗室轉而使用由鱟試劑供應商根據RSE評估確定的效力的細菌內毒素工作標準品（CSE），這一做法無形中增加了測試結果的變異性。

（二）細菌內毒素

實驗室制備的細菌內毒素工作標準品（CSE）源自高度純化的大腸桿菌菌株，主要成分為脂多糖并添加了穩定填充劑，而環境內毒素則通常以未純化的形式存在，為大分子復合物，這導致了在利用CSE進行測定時兩者間存在差異。此外，盡管鱟試劑對細菌內毒素具有高度特異性，但它僅能檢測細菌內毒素分子中負責激活裂解物的脂質A部分。值得注意的是，脂質A部分可能形成未充分分散的聚集體，造成檢測不均勻，從而導致樣品中的細菌內毒素含量被低估。此外，細菌內毒素分子的化學特性和穩定性隨時間推移而發生變化，這進一步影響了檢測結果的準確性。

（三）鱟試劑檢測法本身的變異性

LAL檢測法的變異性較高，范圍在50%至200%之間。這種變異性主要源于細菌內毒素標準曲線的斜率以及多種測試輸入因素的變化，如試管、移液器吸頭、無菌技術、分析技術、移液方法差異、控制標準品制備差異、稀釋液配制變化等。此外，長期儲存稀釋液的變化、交叉污染、產品或樣品干擾、取樣容器、樣品儲存時間和溫度、LAL儀器/模塊變化等也會影響檢測結果，其中部分問題與檢測技術人員操作直接相關。

（四）內毒素濃度

標準系列使用的細菌內毒素濃度越小，誤差顯著性越大。例如，1.0至0.1EU/mL的標準曲線與5.0至0.005EU/mL的標準系列相比，前者在50%至200%的誤差影響范圍內更為穩定。這也是藥典中測試對照品可接受加標回收率為50%至200%的原因之一。

（五）稀釋誤差

測試稀釋尤其是稀釋細菌內毒素和繪制標準曲線時可能出錯。為避免誤差，建議每批細菌內毒素或裂解物常規使用前應由3名技術人員對稀釋系列鑒定并驗證3次。

常規檢測時，不同試驗稀釋順序應一致，且細菌內毒素起始濃度應始終保持相同（通常為1000EU/mL），因為細菌內毒素標準曲線是基于相同的細菌內毒素起始濃度（1000EU/mL）繪制的，這一點可通過查看生產商分析證書或或對比細菌內毒素工作標準品（CSE）與美國藥典內毒素參考標準品（RSE）來驗證。

（六）標準曲線

線性關系標準曲線的一致性是鱟試劑檢測的一個重要特征。線性標準曲線的y軸截距僅發生1%的變化，就會導致細菌內毒素測定值發生30%至35%的變化。因此，控制濁度法LAL檢測的變異性時，需要密切關注起始（反應）時間。

二、評估差異的方法

盡管可以采取措施來降低變異，但遵循良好質量控制的原則，實驗室仍需具備監督和評估的手段，以確保檢測結果的滿意度，并判斷變異是否達到了值得關注的程度。其中一種有效的監督方法就是審查變異系數（CV）。

（一）變異系數（CV）的應用

變異系數是衡量精確度的一個重要指標，以平均值的百分比表示標準差。在鱟試劑檢測中，CV通常表示為測試重復之間的百分比（%CV），可應用于標準曲線點和測試樣品復制。根據裂解物供應商設定的要求，常見的精確度要求是CV不超過10%或25%。%CV值越低，意味著不同測試副本之間的精確度越高，結果越接近。值得注意的是，隨著細菌內毒素濃度的降低，%CV值通常會上升。此外，不同的鱟試劑供應商在鱟試劑檢測的驗收標準和計算%CV值的方法上存在差異。

（二）檢測稀釋錯誤

除了變異系數，稀釋誤差也是評估鱟試劑檢測準確性的重要方面。為了確保檢測的準確性，需要檢查標準曲線上細菌內毒素最高濃度的起始反應時間，確保其處于預期的秒數范圍內，因為即使是微小的起始時間變化也可能顯著影響線性度、斜率和Y-截距，從而對測試結果產生重大影響。

通過對歷史數據進行研究，特別是對前-100次使用細菌內毒素的測試進行評估，可以確定起始細菌內毒素濃度（如5.0EU/ml）的典型起始時間范圍。起始時間是檢測誤差的關鍵指標，因為它直接關系到光度法LAL檢測方法的原理，即裂解液與樣品或標準曲線稀釋液中的細菌內毒素反應的時間越快，細菌內毒素濃度越高。

根據平均值的第二個標準偏差，可以計算出起始濃度的光密度達到所需閾值所需的時間范圍。鑒于LAL檢驗本身存在誤差（通常認為誤差為±25%），為了與其他生物檢驗方法保持一定程度的標準化，第二個標準差可以說是最合適的測量方法。標準差是衡量單個元素偏離平均值（均值）的程度。其計算公式為方差的平方根（如圖1所示）。

在LAL檢測中，使用平均值的兩個標準差來界定起始時間的正常范圍，能確保95%的測試值落在該范圍內，超出此范圍的5%則被視為非典型值。每次檢測后，需將最高細菌內毒素濃度點的起始時間與這一范圍進行對比，以驗證檢測的合格性。

（三）標準曲線相關系數

每次測試都應檢查標準曲線的相關系數（要求相關系數大于或等于0.980），這是藥典要求。標準曲線的一致性很重要，線性標準曲線Y-截距的微小變化會導致細菌內毒素測定結果大幅變化。

（四）陰性對照

每次檢測都要進行陰性對照，陰性對照是構建標準曲線的水樣，可顯示制備細菌內毒素系列時是否污染，其細菌內毒素含量必須低于標準曲線中的最-低細菌內毒素濃度（常規標準系列為0.05EU/mL），這也是藥典要求。

影響LAL檢測的變異性和測試誤差來源眾多，技術人員在設計檢測方法和調查檢測異常時，了解這些因素至關重要。變異系數是衡量變異性的關鍵指標，技術人員審查測試結果時需重點檢查，同時結合檢測稀釋錯誤、標準曲線相關系數和陰性對照等方面的評估，做好實驗室質量控制，以確保LAL檢測結果的可靠性。